高密度发酵和真空冷冻干燥工艺对乳酸菌抗冷冻性的影响
经真空冷冻干燥得到的乳酸菌发酵剂存活率和后期的低温贮藏稳定性与诸多因素相关。本文综述了制备乳酸菌发酵剂过程中高密度发酵和真空冷冻干燥工艺的不同对乳酸菌抗冷冻性的影响，其中高密度发酵过程中的培养基组分、培养温度、发酵恒定pH、中和剂的选择、菌体收获时期和发酵结束后处理以及真空冷冻干燥过程中保护剂的添加、预冷冻处理等是影响乳酸菌抗冷冻性的重要因素。通过对这些相关因素的综述分析，为提高乳酸菌发酵剂的冻干存活率和后期的低温贮藏稳定性提供新的思路，且应用抗冷冻性强、活力高的乳酸菌发酵剂对有效提高乳制品的质量和企业的经济效益意义重大。
近年来，乳酸菌的研究与相关产品的开发得到迅猛发展，但仍有许多问题需要解决，其中乳酸菌发酵剂在真空冷冻干燥过程中的存活率和低温贮藏稳定性极其重要，直接影响着企业的经济效益，而影响乳酸菌抗冷冻性的不仅仅是真空冷冻干燥工艺，更重要的还有前期的高密度发酵工艺，且后者往往被乳酸菌发酵剂生产者所忽视。高密度发酵是近年来发展起来的发酵技术，它不仅是生产高质量的浓缩型菌体和代谢产物的重要环节，也是工程菌和非工程菌能否实现规模生产的关键性因素。高密度发酵得到的菌体需要通过一些手段去除其中的水分，以使得乳酸菌能够长期贮藏并保持较高的活力，并能够方便地应用于乳制品的生产中，而真空冷冻干燥可以满足上述要求，可在真空条件下将预冻样品中的冰直接升华，实现低温条件下去除水分的目的。
目前，最大限度地提高乳酸菌存活率及后期的低温贮藏稳定性至关重要，因此优化乳酸菌的高密度发酵工艺及真空冷冻干燥工艺以提高乳酸菌发酵剂的冻干存活率和贮藏稳定性具有重大意义。
1、乳酸菌高密度发酵工艺对其抗冷冻性的影响
1.1、培养基的组分及含量对其抗冷冻性的影响
培养基的组分对乳酸菌的抗冷冻性影响较大，因此在乳酸菌的培养基优化过程中，不仅要以发酵液活菌数作为参考指标，更重要的是要参考在该种培养基下培养得到的乳酸菌在后期的真空冷冻干燥过程中的存活率，以得到一个具有实际经济效益的培养基。
1.1.1、培养基中的碳源、氮源对其抗冷冻性的影响: 培养基的组分对乳酸菌抗冷冻性影响较大，其中碳氮源是主要的影响因素，培养基中的糖类一方面可作为细胞生长的碳源，另一方面也可作为生长培养基中渗透性应激诱导物。Wang 等对嗜酸乳杆菌RD758 在乳糖缺少的情况下培养并研究其抗冷冻性的变化。在乳糖缺少的情况下嗜酸乳杆菌RD758 表现出较高的抗冷冻性和活力，通过气相色谱对乳糖缺少的培养条件下嗜酸乳杆菌RD758 细胞膜脂肪酸的种类及含量的测定发现，其细胞膜不饱和脂肪酸含量增加，饱和脂肪酸含量减少即细胞膜的流动性增强; 通过双向电泳研究发现乳糖缺少的情况下，有11 种与代谢有关的新蛋白质合成，且另有一种应激蛋白质的合成量是乳糖充足时合成量的3 倍。包维臣等研究表明保加利亚乳杆菌ND02 在不同培养基中发酵时其存活率不同，当培养基的氮源由酵母浸粉变为动物蛋白胨时，其冻干菌粉活菌数由1×109 CFU/mL 变为6×109 CFU/mL，且真空冷冻干燥过程的存活率明显升高。
1.1.2、培养基中的金属离子对其抗冷冻性的影响: 培养基中的金属离子对乳酸菌的抗冷冻性影响较大。嗜酸乳杆菌NCFM 和RL8Kr、RL8Ks在培养基中添加钙离子时，其存活率可提高到80%和89%，显微镜观察发现添加钙离子后其细胞形态由长细丝状变为短杆状，而相关研究表明细胞为短杆状时抗冷冻性较强。
Wright、Bèal 等研究发现培养保加利亚乳杆菌1243-F 和嗜热链球菌CFS2 时，钙离子添加量最适浓度范围是3.4×10−3−6.7×10−3 mol/L，且其抗冷冻能力并不随培养基中钙离子的浓度增高而增强。钙离子所带有的阴离子不仅可有效中和其在培养过程中产生的乳酸，防止其对收获和浓缩前的菌体细胞造成过酸损伤，同时钙离子的添加还可以提高促进因子如油酸和吐温-80 的效力，这是由于冷冻期间细胞内液体状态变为液体冰晶状态降低细胞膜的流动性，改变饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸之间的比例，而不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例越高其抗冷冻能力越强。相关研究表明，当镁离子与钙离子复合使用时，其抗冷冻能力相对减弱; 而与钙离子相反，若在培养基中加入磷酸盐，虽可起缓冲和抗噬菌体作用，
但它可使球菌和杆菌的形态发生改变，从而降低了乳酸菌冷冻干燥中的存活率。Carvalho 等研究发现粪肠球菌EF1 和耐久肠球菌ED1 在锰离子缺失的情况下，大部分乳酸菌对氧自由基的敏感度增加，因为锰离子对存在于细胞内的含锰金属辅基的超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的结构至关重要，可以保障含锰金属辅基的超氧化物歧化酶发挥其作用。这类含锰金属辅基的超氧化物歧化酶在乳酸菌不同的种属中均有发现，对保护乳酸菌抵抗氧自由基有着重要作用，从而对低温条件下乳酸菌稳定性的提高起着积极作用。
1.1.3、培养基中的其它成分对其抗冷冻性的影响: 一些培养基的组分直接影响着乳酸菌细胞膜结构的变化，可以使不饱和脂肪酸含量相对增加。吐温-80 的添加可提高乳酸菌的抗冷冻性，Fonanda 等[7]研究表明，在培养基中添加吐温-80可以改善乳球菌和乳杆菌的活性，增加细胞膜中不饱和脂肪酸的组成，从而改变细胞膜的流动性，进而影响其存活率。钙离子与吐温-80 复合使用对其存活率的提高更有效。
1.2、乳酸菌的生长温度对其抗冷冻性的影响
乳酸菌适宜的生长温度对其抗冷冻性具有重要的影响，很多研究发现细胞的生长温度通过改变其细胞膜内脂肪酸的组成而影响其存活率。嗜酸乳杆菌RD758、嗜酸乳杆菌CRL640、棒状乳杆菌Si3 及保加利亚乳杆菌L2 在30 °C、35 °C、37 °C 分别发酵培养时，通过比较冷冻前后酸化活力的差值可知，在30 °C 培养时其抗冷冻能力最强，冻干存活率高达67%，此时细胞膜内不饱和脂肪酸C18:2 组成明显增加; 此外低温培养还会影响菌体多糖合成，乳酸菌在27 °C 培养比在37 °C 产生的不溶性多糖高3−5 倍，而这种多糖物质可以提高冷冻干燥存活率[8−11]。通过以上综述得知，当乳酸菌在其最适生长温度低2 °C 下培养生长时，能达到较高的抗冷冻性，当生长温度高于或低于最适生长温度10 °C 时，其抗冷冻性会有所下降。
1.3、高密度发酵过程中恒定pH 对乳酸菌抗冷冻性的影响
乳酸菌生长的pH 对其抗冷冻能力具有重要的影响。在优化高密度发酵过程中的恒定pH 时，选择较低的酸性环境更有利于提高乳酸菌的抗冷冻性，但这个过程可能会影响到乳酸菌发酵液的活菌数进而影响到最终的产量，因此在综合诸多因素的情况下，选择较合适的恒定pH 十分重要。
球菌更适合在pH值较高(6.0)的41 °C 条件下生长; 杆菌更适合在pH 值较低(5.0)的41 °C 条件下生长。罗伊氏乳杆菌ATCC55730、嗜酸乳杆菌RD758 和酒酒球菌SD-2a 在恒定pH 为5.0 的培养基中生长时其抗冷冻能力强，而在pH 为6.0−6.8 时抗冷冻能力较差; 当pH 为5.0 条件下培养时细胞膜内不饱和脂肪酸C19:0 比例较高，其抗冷冻性增强。Zavaglia 等研究表明不饱和脂肪酸含量的增加有助于嗜酸乳杆菌抗冷冻特性的提高，而细胞膜内C19:0 脂肪酸含量的增加有助于保加利亚乳杆菌抗冷冻特性的提高。干酪乳杆菌Zhang 和嗜酸乳杆菌CFS2 在pH 为5.8 发酵时，其抗冷冻性较好，通过不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例分析发现，此pH 可以引起细胞膜内不饱和脂肪酸的积累，过酸和过碱都对其生长速率和存活产生一定抑制。但在添加油酸之后，pH 的影响将会失去，因为油酸可使细胞膜流动性增强，有利于细胞的跨膜转运。包维臣研究发现保加利亚乳杆菌ND02 在普通MRS 培养基中生长12 h 后，不同恒定pH 对其细胞形态学影响很大，当pH 为5.7 时细胞形态为细长形，而当pH 为5.0 时细胞呈现短粗状。
1.4、高密度发酵过程中中和剂对乳酸菌抗冷冻性的影响
乳酸菌在生长的过程中会产生大量酸，这些酸会抑制其生长，因此必须选择适当的中和剂使其维持恒定的pH，利于乳酸菌的生长，进而提高其抗冷冻能力。Fonseca 等研究表明，嗜热链球菌CFS2、保加利亚乳杆菌CFL1 及乳脂链球菌ML1 培养时调整pH 所用的中和剂由20%氨水变为20% NaOH 时，其发酵液活菌数由1.1×1010 CFU/mL 变为6.7×109 CFU/mL，其真空冷冻干燥存活率明显降低; 李妍等也研究表明不同的中和剂对干酪乳杆菌Zhang 的生长影响不一，其中25%的氨水效果最好。弱碱氨水更适合作为中和剂是由于氨水中游离的NH4+更容易透过细胞壁刺激其生长，且可以通过降低蛋白水解酶活性而限制糖酵解的速度。张兴昌[17]研究表明不同的中和剂对嗜热链球菌ND03 高密度发酵中耗碱量和存活率的影响差异显著，当中和剂为30% Na2CO3 溶液时，比氨水少消耗约20 mL，但用25%氨水作中和剂时存活率较30% Na2CO3 作中和剂存活率高，因此选择合适的中和剂对乳酸菌的存活率有重要影响。
1.5、菌体细胞的收获时期对其抗冷冻性的影响
乳酸菌在生产的过程中为了得到更高的活菌数，必须把菌体从培养基中离心收集从而使菌体与代谢中产生的毒物(如乳酸盐等)分开，从生理状态上讲对提高冷冻干燥后存活率有益，而收获过程中直接影响生存能力的则是菌体的菌龄。酒酒球菌SD-2a 在生长的过程中随着葡萄糖代谢产物等一系列有机酸的产生，其生长pH 从对数期中期的4.8 下降到稳定期初期的3.6，细胞在此生长过程中细胞膜内不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比率由30.5%降低到26.6%。研究发现在对数期中期收获的菌体较稳定期初期收获的菌体经冻干后的存活率高8 倍，存活率高达85%。Lee 等研究表明，乳乳球菌DRC-2 和DRC-2C在10 °C 预冷处理4 h 后，对数期存活率较低，分别为28.5%和34.7%，而稳定期存活率为60%和61.2%。
1.6、高密度发酵结束后处理对其抗冷冻性的影响
细胞培养结束后的后处理对其抗冷冻性有极其重要的影响，研究发现保加利亚乳杆菌ND02和嗜热链球菌ND03 在培养结束后，将发酵终点的发酵液pH 分别调至6.5 和6.6，温度降低到30 °C 以下离心时，离心后两个菌的产酸活力均高于未调pH 所得菌体，且其冻干后存活率大大提升。张中青等[26]研究发现在对数期末期保加利亚乳杆菌ATCC11842 菌液中添加2% (W/V)NaCl 短暂刺激2 h 后，收集菌体其冻干存活率达
到65%，且存活率是对照组即直接预冻并进行真空冷冻干燥细胞的1.43 倍，因而选择合适的刺激持续时间才能达到良好的效果。同时通过反相
高效液相色谱法测得，菌体胞内磷酸果糖激酶(PFK)在冻干前活性为1.409 5 U/mg，NaCl 刺激后活性提高37.4%; 冻干后活性降低为0.968 5 U/mg，NaCl 刺激使PFK 活性增加31.4%。冷冻干燥过程影响了保加利亚乳杆菌正常生理代谢所需关键酶PKF 的活性，NaCl 刺激能有效地减少冷冻干燥过程对PKF 酶活的影响是由于NaCl 改变了细胞内辅因子水平，进而起到保护细胞的作用。因此高密度发酵结束后处理对乳酸菌存活率有很大的影响。张兴昌[17]研究发现离心前将嗜热链球菌ND03 的发酵液pH 调到6.6，离心后菌种产酸活力高于没调pH，其冻干存活率明显升高。
2、乳酸菌的冻干工艺对其抗冷冻性的影响
2.1、保护剂的添加对乳酸菌抗冷冻性的影响
冻干保护剂是影响冻干发酵剂活力最重要的外部因素，因此乳酸菌在冻干前加入适当的保护剂，可以提高细胞的存活率，并且可以改善保藏期间乳酸菌的稳定性。国内外很多学者对冻干保护剂已有大量的研究，其中甘油和二甲基亚砜的研究揭开了现代冻干保护剂研究的序幕。2010 年Li 等研究发现保护剂中蔗糖以8%添加后对经冷冻干燥的干酪乳杆菌Zhang 具有一定保护作用，冻干后细胞活菌数为3.20 LogCFU/mL。
Giulio 等研究发现德氏乳杆菌DSM20081 冷冻干燥前保护剂有海藻糖的添加其保护效果更好，通过冷冻干燥前后活菌计数结果比较可知冻干存活率显著增加。添加适宜的保护剂可以大大提高乳酸菌的抗冷冻性，因此研究不同种类的保护剂对乳酸菌保护的作用机理，并对添加的保护剂种类和含量进行优化具有重要意义。
2.2、菌体细胞冻干前的预冷处理对其抗冷冻性的影响
细胞经预冷处理后其细胞膜脂肪酸的组成和含量发生变化，且诱导了一些冷激蛋白的合成，用以调节自身对外界的冷刺激。因此，细胞在较低的温度下进行预冷处理可以提高其对于冷冻和低温保藏的耐受能力。
乳酸菌经过预冷处理，在较低的温度下发生冷激反应，可以产生冷激蛋白(CSPs)，饱和脂肪酸转化成不饱和脂肪酸，这些变化对乳酸菌后期的冷冻干燥有极其重要的保护作用。Capozzi等研究了一个热应激基因失活对植物乳杆菌WCFS1 细胞形态和细胞膜流动性的影响，通过扫描电镜观察基因hsp18.55 缺失的突变体发现其细胞成簇且表面粗糙。因此，热应激基因对于乳酸菌细胞膜流动性有着重要的影响。植物乳杆菌NC8、唾液乳杆菌CFR-2158 和嗜热链球菌SFi39及棒状乳杆菌Si3 分别在8 °C、20 °C、26 °C 预冷处理4 h 后较50 °C 处理30 min 后细胞抗冷冻性高，预冷处理后冷激蛋白CspP 明显增加，乳杆菌、短乳杆菌和酒酒球菌H-2 经−65 °C 冷刺激5 h 后，冻干后的存活率为83%。低温条件下CspB 和CspE 的增加可以提高乳酸乳球菌的存活率，而CspP 的增多可以提高植物乳杆菌存活的能力。因此，经过预冷处理的乳酸菌，细胞膜中脂肪酸的比例影响其抗冷冻能力。
2.3、预冷冻速率对其抗冷冻性的影响
细胞在冻结过程中影响菌体存活率的主要因素是冷冻速率，其中缓慢冷冻过程可以增加细胞的抗冷冻性及保护其生理学特性。Bâati 等[30]研究表明，缓慢冷冻可提高细胞的抗冷冻性，嗜酸乳杆菌ATCC4356 在−80 °C 下冻结24 h 活性大大降低，存活率为42.6%，而当其分间断梯度
(37 °C，20 °C，−4 °C，−20 °C，−80 °C)冷冻时其存活率高达74%。乳酸菌在−20 °C 下每20 min 下降1 °C 要比−40 °C 下每分钟下降1 °C 可获得较高的存活率。相关研究表明液氮预冻比在普通缓慢预冷冻条件下保加利亚乳杆菌的存活率高。另外，也有研究报道，冷冻速率在5−180 °C/min 之间时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高。但Dumont 等真核生物菌种适宜慢速冻结，而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后，细胞存活率差异并不显著。
2.4、冷冻干燥过程对乳酸菌存活率的影响
冷冻干燥结束后，在干燥物质的毛细管和极性集团上还吸附着一部分水分，这些是未被冻结的，当它们达到一定含量就为微生物的生长繁殖提供条件。但是，水分含量过高，残留的自由水与蛋白质相互作用，造成蛋白质特定构象的改变，同时冰晶体也会形成，这些都会影响其冻干存活率，降低储存过程中的稳定性。同时降低样品厚度，增大干燥表面积可改善干燥效果，此外采用适度真空度和较高搁板温度(不能使样品熔化)时冰晶升华速度快，能减轻样品过干程度。细胞在冻干的过程中由于真空干燥胁迫细胞失去“结合水”，由代谢过程向休眠状态转化造成部分菌体死亡。研究表明，嗜热链球菌ND03 在升华干燥的过程中，其水分含量由88.3%变为6%，同时活菌数降低了20%，当水分含量由89.1%降至3%时，活菌数仅降低了10%。冻干发酵剂在25 °C 时Aw 值为0.050−0.200 或水分含量为1.5%−3.0%时，发酵剂的贮藏稳定性较高，当水分含量大于3.0%或小于0.5%，发酵剂的冻干死亡率提高，贮藏稳定性降低，因此水分含量是产品质量的重要指标之一。因此在冷冻干燥的过程中必须选择适当的干燥温度和时间，确定一个合理的冻干工艺使得冻干后的含水量在一个比较合适的范围，可以提高冻干存活率，同时可以提高发酵剂贮藏过程中的稳定性。
近几年国内外很多研究表明在制备乳酸菌发酵剂的过程中，高密度发酵和真空冷冻干燥工艺对乳酸菌发酵剂的存活率及后期的低温贮藏稳定性有重要影响，因此在研究乳酸菌发酵剂的抗冷冻性时不仅要进行保护剂的筛选，更重要的是把握制备发酵剂高密度发酵和真空冷冻干燥过程中各项工艺条件对乳酸菌抗冷冻性的重要影响，全面有效地提高乳酸菌发酵剂和发酵产品的质量，进而提高生产效益。
