真空包装罗非鱼冷藏过程生物胺生成与微生物生长的相互关系

　　通过测定真空包装罗非鱼冷藏过程生物胺和主要微生物的变化，建立两者的相关性和回归方程，以探讨生物胺生成与微生物生长的相互关系。结果表明：冷藏过程中，腐胺、尸胺、组胺是优势生物胺；色胺、苯乙胺、酪胺、亚精胺、精胺与微生物生长不相关，其他生物胺指标与微生物生长具有良好相关性；二胺、生物胺指数(BAI)能有效反映总生物胺的变化趋势，用于品质评价更为简便。通过逐步回归分析，获得贮藏时间与生物胺、微生物具有良好拟合度的多元线性回归方程：贮藏时间=0.125×组胺+0.941×厌氧菌+0.022×尸胺-2.918。

　　生物胺是一类具有生物活性的低分子量有机含氮化合物，广泛存在于富含蛋白质和氨基酸的水产品、肉制品、干酪、酒类等食品中。适量的生物胺能有效调节生物体的生理代谢功能，但过量摄入则会导致人体产生血压升高、头痛、皮疹、肿胀、腹泻、呕吐等中毒症状。除了天然胺类，食品中的生物胺主要由微生物产生脱羧酶催化氨基酸脱羧作用生成。生物胺的生成与食品自身特性、微生物菌群以及加工贮藏条件有关，进而影响其前体物质氨基酸的含量以及脱羧酶的活性。

　　目前，已有一些关于金枪鱼、三文鱼、大西洋青鱼、沙丁鱼、雀鳝鱼等海水鱼中生物胺生成情况的研究，生物胺(尤其是组胺和酪胺)已经被欧美国家建议列入海产品的安全限量摄入，然而很少关于淡水鱼中生物胺的研究。罗非鱼是我国重要的淡水经济鱼种，其肉厚刺少风味佳，深受国内外消费者欢迎。冷鲜罗非鱼在加工贮运过程中难免遭受微生物污染并代谢产生有毒有害物质——生物胺，其生物胺的生成情况与微生物生长的相互关系有待研究。

　　本研究以冷藏真空包装罗非鱼为研究对象，检测其常见主要生物胺的含量，同时测定微生物及其他品质指标的变化，建立生物胺与微生物生长的相互关系和回归方程，为今后基于生物胺变化预测安全食用货架期提供理论参考。

　　1、材料与方法

　　1.1、材料与试剂

　　厌氧菌琼脂、发光菌琼脂、MRS琼脂 青岛海博生物技术有限公司；STAA琼脂 英国Oxoid公司；乙腈、丙酮、高氯酸 北京蓝弋生化试剂有限公司；生物胺标准品 美国Sigma公司。

　　1.2、仪器与设备

　　JG21002电子天平 上海天平仪器厂；KDY-9820凯氏定氮仪 北京通润源机电技术有限责任公司；3K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司；LC-10 AT液相色谱仪日本岛津公司；C18-Diamondsil(25cm × 4.6mm，5μm)反相色谱柱 迪马科技有限公司。

　　1.3、方法

　　1.3.1、贮藏实验

　　鲜活淡水罗非鱼击杀加工成生鲜鱼片，清洗，滤水晾干，每片鱼片独立真空包装后放置于保温箱中，一层鱼一层冰确保低温运往实验室；抵达实验室后，去除冰块，将包装好的鱼片放置于(5.13 ± 0.51)℃冰箱中贮藏。贮藏过程每隔一段时间随机取3片鱼片进行分析。

　　1.3.2、指标测定

　　1.3.2.1、生物胺测定

　　生物胺采用反相高效液相色谱柱前衍生法测定，按照Kim等[9]方法略作修改：准确称5g混匀肉样，加15mL预冷的0.6mol/L高氯酸，均质后高速低温离心15min，取上清液；重复操作1次，合并2次上清液并定容。取1mL样液，依次加入200μL 2mol/L NaOH、300μL饱和碳酸氢钠溶液和2mL丹磺酰氯，40℃避光反应45min。然后加入100μL氨水，静置30min，用乙腈定容至5mL，混匀，3000r/min离心10min，有机微孔滤膜过滤，滤液直接测定或于-20℃贮存备用。检测条件：流动相为0.1mol/L醋酸铵和乙腈，流速0.8mL/min，检测波长254nm，进样量10μL。采用外标法测定各种生物胺的含量。

　　单胺=色胺+苯乙胺+组胺+酪胺；二胺=腐胺+尸胺；多胺=精胺+亚精胺；总生物胺=色胺+苯乙胺+组胺+酪胺+腐胺+尸胺+精胺+亚精胺。生物胺指数(biogenic amine index，BAI)=组胺+腐胺+尸胺+酪胺；质量指数(quality index，QI)=(组胺+腐胺+尸胺/(1+亚精胺+精胺)。

　　1.3.2.2、微生物测定

　　无菌操作称25g鱼肉置于225mL无菌生理盐水中，振荡均匀，做10倍系列稀释，选取适宜稀释度接种于选择性培养基。厌氧菌采用厌氧菌琼脂，接种于厌氧管中，30℃培养48h；乳酸菌接种于MRS琼脂，30℃培养72h；明亮发光杆菌采用发光菌分离培养基，25℃培养48h；热杀索丝菌采用STAA琼脂于25℃培养48h。计算典型菌落，换算成对数值(lgCFU/g)。

　　1.3.2.3、三甲胺氮测定

　　三甲胺氮(trimethylamine-nitrogen，TMAN)测定参考Malle等方法进行：准确称10g混合肉样，加90mL预冷的0.6mol/L高氯酸，均质，低温静置30min，3000r/min离心15min，过滤，取5mL滤液，加入10mL浓甲醛，置于半自动凯氏定氮仪中蒸馏6min，甲醛能与一级和二级胺反应生成六亚甲基亚胺，游离的三甲胺被蒸馏出来，接收液中则是三甲胺的含量，采用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至中性，通过盐酸溶液用量换算TMAN含量。

　　1.3.2.4 酸度测定

　　酸度的测定参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》酸碱滴定法。

　　3、结论

　　真空包装罗非鱼冷藏过程中，腐胺、尸胺、组胺是优势生物胺；二胺和BAI能有效反映总生物胺的变化；厌氧菌和明亮发光杆菌生长良好，最高数量超过8.0(lg(CFU/g))；色胺、苯乙胺、酪胺、亚精胺、精胺与微生物生长不相关，其他生物胺指标与微生物生长具有良好相关性；二胺和BAI作为生物胺评价指标的应用性可能更简便；通过多指标逐步回归分析获得良好拟合度的多元线性回归方程：贮藏时间(y)=0.125×组胺+0.941×厌氧菌+0.022×尸胺-2.918。