不同真空处理时间对SOD、HRP和α-AMY活性的影响

　　将超氧化物歧化酶（SOD）、辣根过氧化物酶（HRP）和淀粉酶（α- AMY）置于真空环境中不同时间，测试真空对超氧化物歧化酶、辣根过氧化物酶和α－淀粉酶活性的影响。不同真空处理时间对酶蛋白活性有不同影响，在处理时间为3～15 min 范围，超氧化物歧化酶、辣根过氧化物酶和α－淀粉酶相对活性基本上都呈降低的趋势。因此，在离子注入生物效应的研究中，应该考虑真空对生物体所产生的影响。

　　低能离子注入生物技术已被成功地应用于农作物改良、细胞刻蚀和转基因工程等方面。目前，对其机理的研究多集中在细胞和个体水平上，对分子水平上的辐照损伤如DNA 链的断裂、核甘酸和碱基损伤的研究也取得了一定的进展。但由于离子注入过程是在真空条件下进行的，那么，真空本身对生物体特别是生物大分子是否存在影响， 是值得研究的一个问题。本文以SOD(超氧化物歧化酶)、HRP(辣根过氧化物酶)和α- AMY(α－淀粉酶)为研究对象，将酶蛋白置于离子注入时的真空条件下不同时间， 研究了不同真空时间对其活性的影响。研究结果对离子注入生物体效应的机理分析与应用研究具有重要的意义。

1、材料与方法

1.1、材料

　　辣根过氧化物酶结晶粉末(购自于北京拜尔迪生物技术公司，标定酶活力为250 u/mg)；超氧化物歧化酶(购自于华东理工大学生物工程学院，标定酶活力为1000 u/mg)；α- 淀粉酶(购自于Sigma 公司，标定酶活力为1.8 u/mg)。

1.2、实验设备

　　紫外- 可见分光光度计（TU- 1800PC 型，北京谱析通用公司）、精密酸度计（PHS- 2C 型，上海康仪仪器有限公司）、电子天平（BP310S 型，北京塞多利斯仪器系统有限公司）。

1.3、实验方法

1.3.1、样品的处理

　　取一定质量的测试样品放置于培养皿中，样品面积约6 cm2，厚度大约1.0 mm。将样品置于离子注入机（中国科学院等离子研究所）靶室中对样品进行处理，待真空度达到10^{- 3} Pa 时（离子注入真空条件），开始计时，真空处理样品时间分别取t＝3 min，6 min，9 min，12 min，15 min。

1.3.2、活性的测定

　　SOD 活性的测定按季键平的方法进行；HRP 活性测定按张龙翔的方法进行；α－淀粉酶按李合生方法进行。酶蛋白的相对活性定义为：

　　其中At 为处理组样品活性，A0 为对照组样品活性。

2、实验结果

2.1、真空对超氧化物歧化酶活性的影响

　　图1 给出不同真空处理时间对超氧化物歧化酶相对活性的影响。可以看出，不同处理时间入对超氧化物歧化酶相对活性的影响程度不同。与对照相比，真空处理时间为6 和9 min 时，酶相对活性分别增加了为49.7%和39.3%；真空处理时间为3、12 和15 min 时，酶相对活性分别降低了35.8%、73.1%和48.4%。

图1 不同真空时间对SOD 相对活性的影响

2.2、真空对辣根过氧化物酶活性的影响

　　图2 给出了不同真空处理时间对辣根过氧化物酶相对活性的影响。结果表明，不同处理时间对辣根过氧化物酶相对活性的影响程度不同。与对照相比，辣根过氧化物酶经真空处理后其相对活性均降低，降低幅度在1.0%～40.2%，其中处理时间为6 min 时，降幅最小，处理时间为9 min 时，降幅最大，但在处理时间为3 min时，相对酶活性增加26.2%。

图2 不同真空时间对HRP 相对活性的影响　图3 不同真空时间对α－AMY 相对活性的影响

2.3、真空对α－淀粉酶活性的影响

　　图3 给出了不同真空处理时间对α－淀粉酶相对活性的影响。可以看出，不同处理时间入对α－淀粉酶相对活性的影响程度不同。与对照相比，α－淀粉酶经真空处理后其相对活性均降低，降低幅度在2.4%～25.7%，其中处理时间为12 min 时，降幅最小，处理时间为15 min 时，降幅最大。

3、讨论

　　已有研究表明：离子注入干种子过程中一般含水量损失大约50%；当细胞或愈伤组织突然暴露于真空靶室时，由于表面水分的蒸发带走了大量的汽化热，细胞或愈伤组织自身温度迅速的下降，当达到相平衡时，两相界面的温度应降至0℃以下。可知此时的细胞或愈伤组织表面的水分早已形成冰壳。如果维持真空度不变（蒸汽压不变），则冰壳表面的温度不变。在热传导的作用下，整个愈伤组织和细胞的水分将结冰。在进行离子注入活体生物实验时，生物活体不仅散失大量的水分，而且还受到冷冻的影响。

　　真空处理过程必然伴随脱水的过程。水分子的存在可以增加氢键形成的几率，当两个球蛋白分子在水溶液中互相靠近时，由于水分子的作用，蛋白分子相应肽段之间形成一定形式的β 折叠，这种β 折叠比正常的分子内β 折叠的能量高，稳定性较低。从能量角度讲α- 螺旋比β-折叠稳定，而无规卷曲结构是最不稳定的。因此从这个意义上考虑, 超氧化物歧化酶、辣根过氧化物酶和α－淀粉酶在真空过程中可能由于有序结构含量的减少，无序结构含量的增加导致了其相对活性的下降。

　　我们的研究结果表明，在离子注入生物效应的研究中，应该考虑真空对生物体所产生的影响，不能完全归之于注入离子的生物效应。