不同真空处理时间对辣根过氧化物酶二级结构的影响

　　辣根过氧化物酶经真空处理不同时间，利用圆二色光谱研究不同真空处理时间对辣根过氧化物酶二级结构的影响。结果表明：在3~15 min 时间内，不同真空处理时间对辣根过氧化物酶的α- 螺旋、β- 折叠、β- 转角及无规卷曲相对含量产生不同程度的影响，但是影响程度较小，表明辣根过氧化物酶二级结构相对力学作用具有较高的稳定性。

　　离子注入技术作为有效改善材料表面性能的表面改性技术，已广泛应用于半导体材料掺杂，金属、陶瓷、高分子聚合物等诸多材料的表面改性中。20 世纪80 年代，中国科学家进行了低能离子注入生物体效应的研究与探索，研究结果已被成功地应用于农作物改良、细胞刻蚀和转基因工程等方面。低能离子注入生物体效应机理的研究也取得了部分结果，理论上提出了低能离子与生物体作用时的能量沉积、质量沉积、动量交换和电荷交换等四因子观点，实验上发现了低能离子注入对酶活性的影响、细胞核和细胞质的诱变作用以及致使DNA 碱基多位点、高密度变异等。这些结果为离子注入生物效应提供了重要的理论依据。但是由于离子束技术本身的原因，离子束对样品的处理是在真空中进行的。那么，真空本身对生物体是否存在影响，是值得探讨的问题。

　　酶在生命活动过程中，扮演着极其重要的角色。理论研究表明，酶蛋白的空间结构对酶的功能至关重要，即使极其细微的扰乱，也能够极大地影响酶的活性。酶蛋白不是刚性分子，它的功能依赖于结构的这种运动性。光谱技术是研究生物蛋白质构象的一种有效途径，其中圆二色(Circular Dichroism 简写为CD)光谱可以灵敏地反映出蛋白质构象的变化,已被广泛应用于蛋白质的构象研究中。

　　本文以HRP(辣根过氧化物酶)为研究对象，将酶蛋白置于离子注入时的真空条件下在不同时间，研究不同真空处理时间对其二级结构的影响。研究结果对离子注入生物体效应的机理分析与应用研究具有重要的意义。

1、材料与方法

1.1、材料

　　辣根过氧化物酶结晶粉末(购自于北京拜尔迪生物技术公司，RZ≥3.0 单位酶活/mg)。主要试剂：30% 过氧化氢、愈创木酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。

1.2、实验设备

　　离子注入机（中国科学院等离子物理研究所）、圆二色光谱仪（Jasco- 715 型，日本Jasco 公司）、紫外- 可见分光光度计（VIS- 723G 型，北京瑞利分析仪器公司）、精密酸度计（PHS- 2C 型，上海康仪仪器有限公司）、电子天平（BP310S 型，北京塞多利斯仪器系统有限公司）。

1.3、实验方法

1.3.1、样品的处理

　　取一定质量的测试样品放置于培养皿中,样品面积约6 cm2。将样品置于离子注入机靶室中对样品进行处理，待真空度达到10- 3 Pa 时（离子注入真空条件）开始计时，真空处理样品时间分别取t＝3 min，6 min，9 min，12 min 和15 min。

1.3.2、 CD 谱测定

　　CD 光谱分析的酶液浓度为0.2 mg/ml（使用0.05 mol/L，pH=7.3 的PBS 溶解）。石英样品池的光程为0.1 cm，灵敏度为2 mdeg/cm，扫描测定波长范围为190~250 nm，扫描时间0.5 s,扫描速度为3.3 nm/s，分辨率为0.01 mdeg，在室温下进行测定。CD 谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为deg·cm2·dmol- 1，所有圆二色数据经四次扫描取平均值。得出CD 谱后，用Selcon3[8,9]软件计算辣根过氧化物酶的二级结构含量。

3、讨论

　　蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中局部肽段的构象，α- 螺旋和β- 折叠结构中存在较多的氢键，导致规则二级结构具有一定的刚性；β- 转角以及无规卷曲中不存在氢键或其它的相互作用，使肽段中的各个残基间有更大的自由度，没有刚性，从而表现出极大的柔性。蛋白质分子中α- 螺旋、β- 折叠的稳定性主要取决于分子内部的氢键。氢键在蛋白质的结构和功能中，尤其是二级结构的形成中非常重要。水分子的存在可以增加氢键形成的几率，真空处理辣根过氧化物酶过程伴随脱水的过程。由于水分子的减少，形成氢键的几率降低，因此蛋白质二级结构会发生变化。本文研究结果表明，真空对辣根过氧化物酶作用过程中，α- 螺旋、β- 折叠、β-转角以及无规卷曲使随着不同真空处理时间的增加，呈非单调型变化，但是变化幅度不大。表明辣根过氧化物酶二级结构相对力学作用具有较高的稳定性。在3～15 min 的真空条件下，辣根过氧化物酶经真空处理后其相对活性基本上降低。这可能是由于真空作用对HRP 高级结构的微扰，使HRP 活性中心卟啉环的微结构发生了变化，导致HRP 的相对活性降低。

　　我们的研究结果表明，在离子注入生物效应的研究中，应该考虑真空对生物体所产生的影响，不能完全归之于注入离子的生物效应。